一、前言

本指導原則旨在指導注冊申請人對胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒(高通量測序法)注冊申報資料的準備及撰寫,同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對該類試劑的一般要求,申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用,若不適用,需具體闡述理由及相應的科學依據,并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。如申請人認為有必要增加本指導原則未包含的研究內容,可自行補充。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件,但不包括注冊審批所涉及的行政事項,亦不作為法規強制執行,如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法,也可以采用,但需要提供詳細的研究資料和驗證資料,相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的,隨著法規和標準的不斷完善,以及科學技術的不斷發展,本指導原則相關內容也將適時進行調整。

二、適用范圍

(一)臨床背景

兒染色體非整倍體(fetal chromosome aneuploidies)中的21三體、18三體、13三體(trisomies 21、18、13,即T21、T18、T13)是臨床上最常見的染色體非整倍體疾病。其對應的分別21-三體綜合征(又稱唐氏綜合征,先天愚型或Down綜合征)、18-三體綜合征(又稱Edwards綜合征)和13-三體綜合征(又稱Patau綜合征),發病率分別約為1/700、1/6000、1/10000,患兒絕大多數存在嚴重智力障礙及器官畸形,生活無法自理,不僅影響兒童的生命健康和生活質量,同時影響經濟社會的健康可持續發展。

依據《中華人民共和國母嬰保健法》,為了保障母親和嬰兒健康,提高出我國出生人口素質,醫療保健機構應當為育齡婦女和孕產婦提供孕產期保健服務。產前篩查和產前診斷即是為避免產生遺傳缺陷患兒提供的有效手段。常規的產前篩查方法包括:早孕期的超聲與血清學聯合篩查和中孕期母體血清學篩查。中孕期母體血清學篩查是指通過中孕期母體血清甲胎蛋白、血清人絨毛膜促性腺激素、血清人絨毛膜促性腺激素游離?亞基、抑制素A和非結合雌三醇指標結合孕婦的年齡、體重、孕周、病史等進行綜合風險評估,得出胎兒是否罹患相關三體綜合征或神經管缺陷的風險度。篩查結果為高風險的孕婦經建議經產前診斷進行最終確認,由孕婦知情選擇。胎兒染色體異常的產前診斷金標準為介入前產前診斷手術,是指通過絨毛取材術/羊膜腔穿刺術/經皮臍血管穿刺術,取相應細胞采用細胞生物學方法對胎兒染色體進行核型分析。

我國對以下孕婦均實行產前診斷:35歲以上的高齡孕婦;產前篩查出來的胎兒染色體異常高風險的孕婦;曾生育過染色體病患兒的孕婦;產前B超檢查懷疑胎兒可能有染色體異常的孕婦;夫婦一方為染色體異常攜帶者;醫師認為有必要進行產前診斷的其他情形。

(二)高通量測序法進行產前篩查

高通量測序(High-Throughput Sequencing)是近年來迅速發展的測序技術,又稱做下一代測序(NGS,Next Generation Sequencing)或大規模平行測序(MPSS,massively parallel signature sequencing)。相較于以Sanger測序為代表的第一代測序技術,其檢測通量高,靈敏度高,速度快,隨著近年來檢測成本的降低,逐漸由科研轉入臨床應用研究。但從檢測的準確性上說,第一代測序技術目前仍然是測序檢測的金標準。

從全球范圍看,高通量測序在臨床應用最廣的方面為胎兒染色體非整倍體的產前篩查。其原理是:孕婦母體血漿中存在胎兒游離DNA(cffDNA,cell-free fetal DNA), 長度約為75bp-250bp,幾乎全部來源于胎盤的滋養層細胞,其濃度和孕周密切相關并以一定比例(5%-30%)穩定存在于母體外周血漿中。取母體血漿提取包含正常母體和胎兒的血漿游離DNA,通過文庫構建技術,經過片段擴增,最后進行上機測序,通過軟件分析數據獲得染色體數目評價結果。當對懷有T21胎兒的母體血漿游離DNA數據進行分析時,其21號染色體游離DNA總數會有小比例的升高,通過統計學算法區分這一微小差異來實現利用cffDNA進行胎兒染色體非整倍體的產前篩查。但高通量測序法不能對染色體結構異常進行檢測,不能代替傳統篩查中的開放式神經管缺陷篩查等。

  (三)適用范圍

本指導原則所述的高通量測序法,指的是通過文庫構建、片段擴增進而進行上機測序的第二代高通量測序方法,不需要進行片段擴增的第三代、第四代單分子測序方法在文中并未涉及。但高通量測序技術發展迅速,第三代、第四代單分子測序方法如果在企業內部參考品設置、性能評估或臨床評價等處如有適用的方面,可以參照執行。

適用人群:本指導原則預期用途為對孕周12周(包含12周)以上的孕婦進行產前篩查,其結果不能代表對孕婦懷有三體胎兒的確認,產前篩查的結果必須要經過產前診斷進行確認。

倫理學問題:終止妊娠應在遵守我國相關法律法規和行業規定的前提下由醫師提出建議,由夫妻雙方知情選擇,該項檢測不得作為終止妊娠的依據。

三、基本要求

 (一)綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及其他等內容,其中其他包括同類產品在國內外批準上市的情況,應著重從方法學及檢出限等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》(總局令第5號)和《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》(國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號)的相關要求。

綜述資料應詳細闡明檢測原理,可配合圖示并寫明一個完整檢測配合使用的全部試劑及耗材名稱、生產廠家、貨號或注冊證書號以及詳細的組成成分。

(二)主要原材料的研究資料

主要原材料的研究資料包括企業內部參考品和完成檢測所需試劑組成兩部分。

1. 企業內部參考品應至少包括:陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、嵌合體參考品,具體要求如下:

1.1陽性參考品:應采用T21、T18、T13胎兒DNA片段按一定比例與正常女性血漿混合的模擬樣本,T21、T18、T13胎兒DNA片段可由流產組織或羊水細胞等來源制備。

1.2陰性參考品:應包括采用染色體數目正常胎兒DNA片段按一定比例與正常女性血漿混合的模擬樣本,以及采用其他染色體異常胎兒DNA片段按一定比例與正常女性血漿混合的模擬樣本。其他染色體異常的陰性參考品由申請人依據常見染色體異常項目并根據對產品的質控要求自行選擇。

1.3檢測限參考品:應采用T21、T18、T13胎兒DNA片段按不同比例梯度與正常女性血漿混合的模擬樣本,如5%、3.5%、2.5%等,建議采用95%(n≥20)的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準。

1.4嵌合體參考品:由申請人按照對產品的質控要求自行設定模擬T21、T18和T13嵌合體的組成比例,如70%異常,30%正常;30%異常,70%正常等。

申請人應詳細說明企業內部參考品的組成、詳細說明制備及檢定方法、胎兒DNA片段濃度確認方式和所占比例的選擇依據。企業內部參考品中各類型均應設置多個重復。

2. 完成全部檢測流程所需試劑應至少包括:血漿游離DNA提取純化試劑、文庫構建試劑、文庫定量試劑、測序試劑、陰、陽性質控品,以及與之配合使用的測序芯片和數據分析軟件。具體要求如下:

2.1血漿游離DNA提取純化試劑:該試劑分類界定為一類試劑,無論申報產品中包含或是配合使用,申請人均應提供該試劑提取純化原理、生產廠家及貨號或一類備案憑證號,提交詳細組成成分資料。性能方面需對該試劑提取的DNA片段準確性及純度要求,提取效率、重復性及抗干擾能力進行評估。

2.2文庫構建試劑、文庫定量試劑、測序試劑:文庫構建試劑通過對片段化的DNA進行缺口補平及相應部分5’端磷酸化和3’端去磷酸化之后使用連接酶加上用于測序和分析的標簽和接頭,構建成可以用來測序上機的標準文庫;文庫定量試劑通過PCR擴增及與標準品曲線的比對,用于定量測定文庫濃度,為后續均一化文庫進行上機測序做準備,同時能夠評估文庫構建的質量。文庫定量時應明確對文庫質量、片段大小及濃度要求,應提供分析圖譜,對其中參數進行解釋說明(如是否有雜峰,產生的原因,是否對最終結果產生影響等);測序試劑用于對均一化的文庫進行片段擴增,通過基因測序儀捕捉擴增過程中堿基的變化引起的信號變化來達到讀取序列的目的。

以上三種試劑一般由:相應功能的酶(末端修復酶、DNA連接酶、缺口修復酶DNA聚合酶等)、核苷酸序列(引物、接頭序列、標簽序列、文庫定量標準品)、緩沖液及dNTP組成。具體要求如下:

2.2.1酶:應提交純度、活性和穩定性資料,提交功能性試驗資料。例如:文庫構建過程包括但不限于末端修復酶、DNA連接酶、缺口修復聚合酶等,所選擇的酶應當具有末端突出削平、缺口補平、標簽或接頭連接、DNA聚合酶活性;

2.2.2核苷酸序列:應提交相應的序列組成和純度信息,序列準確度及穩定性資料;引物設計應提交引物設計原則及選擇對比依據;

2.2.3緩沖液:緩沖液應明確詳細的組成及各鹽濃度選擇對比的依據;

      2.2.4 dNTP:包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP,應提交對純度、濃度、保存穩定性等的詳細驗證資料。

2.3陰、陽性質控品:須能夠監控DNA片段提取到最終測序結果全過程,因此應當由陰、陽性(T21、T18和T13)胎兒DNA片段按已知比例與正常女性血漿基質混合組成。

2.4測序芯片:應詳細闡明芯片進行片段擴增原理及結構,明確使用芯片型號,并對同一次測序芯片上樣的樣本間精密度進行評價。

2.5數據分析軟件:舉例介紹原始數據質量評估、數據處理和篩選的方法,明確數據篩選依據以及使用的算法。

      2.6除上述材料外,還需提交不同原材料對于最終測序數據質量影響的評估材料。由于各測序平臺的技術側重點不同,數據質量評估的項目可能存在差異,需考慮包括但不限于以下方面:文庫濃度、文庫片段大小、單樣本總序列數(數據量)、唯一比對率、單次檢測的GC gap(最高GC值與最低GC值的差值)以及錯誤率等。

綜上所述,申請人應提交主要原材料的篩選依據及試驗資料。如為自制,則應提交:制備方法、質量要求、質量檢測方法、對比篩選的試驗資料等;如為外購,則應提交:外購證書、質量要求、質量檢測方法、對比篩選的試驗資料等。其中,對比篩選的試驗資料應包括篩選過程中的數據、圖譜、對比圖表等信息。

下載原文:

胎兒染色體非整倍體 檢測試劑盒技術審查 指導原則.docx